Chlamydophila pneumoniae у больных коронарным атеросклерозом. Контаминация клеток или заражение организма?

Цель

Оценить локальную и системную инфицированность бактерией Chlamydophila pneumoniae (Cpn) у больных коронарным атеросклерозом.

Материалы и методы

Обследованы 63 больных (основная группа) ишемической болезнью сердца (ИБС) и 35 сопоставимых по полу и возрасту (в среднем 63 года) пациентов без каких-либо клинических проявлений атеросклероза (контрольная группа). Внутриклеточные включения Cpn визуализировали методом непрямой иммунофлюоресценции (НПИФ) в клетках дыхательных путей, крови, а у больных ИБС также и в клетках эндотелия коронарных артерий, которые получали при ангиопластике. Методом иммуноферментного анализа (ИФА) оценивали серологические признаки данной инфекции.

Результаты

Включения Cpn у больных основной и контрольной групп были обнаружены в клетках дыхательных путей в 52% (33/63) и 31% (11/35) случаев (p=0,045), соответственно, в крови – в 65% (41/63) и 62% (21/34) случаев (p=0,75), в клетках эндотелия коронарных артерий – у 51% (32/63) больных основной группы. Концентрация IgG к Cpn в двух группах составила 146,5 (54; 240) и 97 (29,5; 154,5) усл. ед./мл (p=0,046), IgA – 40 (18; 75) и 14 (0; 60) усл. ед./мл (p=0,027), соответственно.

Заключение

Cpn-инфекция часто встречается как у больных коронарным атеросклерозом, так и сопоставимых по полу и возрасту людей без признаков коронарного атеросклероза. Возможность прижизненного обнаружения включений Cpn в эндотелиоцитах из очагов поражения коронарных артерий позволила охарактеризовать Cpn-инфекцию у больных ишемической болезнью сердца как хроническую генерализованную.

Ключевые слова

Атеросклероз, эндотелиоциты, Chlamydophila pneumoniae.

Руководствуясь общепринятой концепцией развития атеросклероза, врачам нередко бывает трудно или невозможно судить о том, почему возникло это заболевание у данного пациента, если традиционные факторы сердечно-сосудистого риска у него отсутствуют или слабо выражены. Недоумение может вызывать и волнообразное течение болезни. Чем вызвана ее первая вспышка в форме внезапного появления симптомов, иногда со стороны сразу нескольких артериальных бассейнов? Почему в определенный момент времени течение атеросклероза вдруг становится галопирующим (даже в условиях тщательной стандартной профилактики), хотя прежде оно было вполне ровным и спокойным? Наконец, почему повреждение обычно бывает локальным, хотя большинство факторов риска действуют системно? Это, например, можно отнести к сосудистому воспалению, активно изучаемому в последние годы в клинических условиях, в основном как системное явление, впервые же описанному Рудольфом Вирховым как локальное явление – в атеромах, post mortem.

Внимание в настоящей работе было сфокусировано на прижизненном изучении при коронарном атеросклерозе альтернативного фактора риска данного заболевания, а именно инфекции, вызванной бактерией Chlamydophila pneumoniae (Cpn). Этот возбудитель наряду с другими бактериями (Porphyromonas gingivalis и Helicobacter pylori) и вирусами (гриппа A, гепатита С, иммунодефицита человека, цитомегаловирусом и др.) аргументированно рассматривается в ряду факторов риска атеросклероза [1,2].

Целью исследования было оценить локальную и системную (генерализованную) инфицированность Cpn больных коронарным атеросклерозом, чтобы лучше понять целесообразность диагностики и лечения этой инфекции. Для этого у больных ишемической болезнью сердца определяли частоту обнаружения Cpn в клетках верхних дыхательных путей, крови, клетках эндотелия коронарных артерий, а также изучали индивидуальный гуморальный иммунный ответ на инфицирование.

Материал и методы

В исследование включали пациентов с ишемической болезнью сердца, которым по общепринятым показаниям выполняли коронарографию и баллонную ангиопластику коронарных артерий. Критерием исключения были острые респираторные инфекции и обострения хронических заболеваний дыхательных путей в течение предшествующего месяца. Основное значение придавали выявлению in vivo хламидофильных включений в эндотелиоцитах коронарных артерий, пораженных атеросклерозом. Эти клетки получали методом внутрисосудистой баллонной биопсии, описанным нами ранее и запатентованным [3,4]. Кроме того, оценивали частоту обнаружения хламидофильных включений в клетках верхних дыхательных путей – входных воротах инфекции, а также в лейкоцитах крови – одного из показателей течения генерализованного (системного) инфекционного процесса, вызванного Cpn. Дополнительно оценивали серологические признаки инфекции.

Хламидофильные включения визуализировали в препаратах клеток методом непрямой иммунофлюоресценции (НПИФ), используя первые видоспецифические моноклональные антитела (sc-57665) к бактерии Cpn, вторые антитела (sc-2010), меченные флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) производства компании Santa Cruz Biotechnology (США). Результат считали положительным, если в препарате (не менее 15-20 клеток) в 5-7 клетках на темно-зеленом фоне цитоплазмы определялись яркие светло-зеленые хламидофильные включения.

Гуморальный иммунный ответ больных на инфицирование оценивали по концентрациям в крови специфических IgA и IgG к Cpn. Их определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА), используя тест-систему производства фирмы Medac (Германия). Подготовка исследуемого материала, техника постановки, учет результатов соответствовали инструкции по применению тест-системы. Кроме названных специальных параметров, учитывали показатели рутинного клинического анализа крови.

Медико-статистическую обработку результатов выполняли в программах STATISTICA 10 фирмы StatSoft Inc. (США). Характер распределения количественных признаков анализировали при помощи критерия Шапиро-Уилка. Признаки, имевшие приближенно нормальное распределение, описывали в формате численных значений M (s), где M – среднее значение, s – среднее квадратическое отклонение. Признаки с ненормальным распределением описывали в формате Me (LQ; UQ), где Me – медиана, LQ – 25-й процентиль, UQ – 75-й процентиль. При сравнении изуча емых показателей двух независимых групп использовали t-критерий Стьюдента (в случаях, если оба сравниваемых показателя имели признаки нормального распределения), U-критерий Манна-Уитни (в случаях, если один или оба из сравниваемых показателей не имели признаков нормального распределения). Качественные признаки представляли, указывая проценты и абсолютные значения, например, 51% (32/63). Сравнение групп по качественному признаку выполняли, используя критерий χ2 по Пирсону.

Результаты

Обследовано 98 пациентов. Основную группу составили 63 больных ишемической болезнью сердца, в том числе стабильной (на фоне стандартного лечения) стенокардией напряжения 2-3 функциональных классов (n=9), прогрессирующей стенокардией (n=25), острым инфарктом миокарда (n=29). По общепринятым показаниям им была выполнена коронарография и баллонная ангиопластика коронарных артерий. Контрольную группу составили больные (n=35) гипертонической болезнью или варикозной болезнью вен нижних конечностей без каких-либо клинических проявлений атеросклероза и без необходимости в коронарографии (табл. 1). Возраст больных был от 34 до 88 лет, в среднем – 63 года.

ТАБЛИЦА 1. Характеристика двух групп пациентов
Основная
группа (n=63)
Контрольная
группа (n=35
p
Возраст, лет 65 (56; 74) 59 (55; 66) 0,20
Мужчины/женщины 36/27 16/19 0,28
Курильщики, n (%) 20 (32) 7 (20) 0,31
Ожирение, n (%) 25 (42) 11 (38) 0,74
Сахарный диабет, n (%) 23 (37) 4 (11) 0,01
Глюкоза крови, ммоль/л 6,4 (5,5; 7,5) 5,6 (5,2; 6,5) 0,10
Общ. холестерин, ммоль/л 4,9 (4,4; 5,8) 5,9 (1,6) 0,03
Липопротеиды низкой
плотности, ммоль/л
3,0 (2,6; 4,2) 4,0 (1,4) 0,20
Гипертония, n (%) 62 (98) 25 (71) 0,0002
Хроническая болезнь почек, n (%) 30/60 (50) 21/30 (70) 0,07

Основная и контрольная группы существенно не различались по возрасту и половому составу. Тради цион ные факторы риска атеросклероза, такие как курение, ожирение и дислипидемия, встречались одинаково часто в двух группах. В основной группе значительно чаще отмечались сахарный диабет 2 типа, артериальная гипертония и гипертрофия левого желудочка (по данным эхокардиографии).

Визуализация хламидофильных включений методом непрямой иммунофлюоресценции с применением первых моноклональных антител к бактерии Chlamydophila pneumoniae, вторых антител, меченных ФИТЦ
Рис. 1. Визуализация хламидофильных включений методом непрямой иммунофлюоресценции с применением первых моноклональных антител к бактерии Chlamydophila pneumoniae, вторых антител, меченных ФИТЦ Столбцы: клетки цилиндрического эпителия слизистых носовых ходов, не содержащие (столбец 1) и содержащие хламидофильные ключения (столбец 2); лейкоциты венозной крови, не содержащие (столбец 3) и содержащие хламидофильные включения (столбец 4); эндотелиоциты коронарных артерий, не содержащие (столбец 5) и содержащие хламидофильные включения (столбец 6). Люминесцентная микроскопия. Увеличение объектива ×100.

При использовании метода НПИФ в эндотелиоцитах коронарных артерий в зоне их критического повреждения, подвергнутого баллонной катетерной реконструкции, у 51% (32/63) больных основной группы выявлены единичные или множественные хламидофильные включения (рис. 1). С такой же частотой включения Cpn отмечены у больных этой группы в эпителиоцитах слизистой оболочки носа, причем значительно чаще, чем в контрольной группе. В лейкоцитах периферической крови хламидофильные включения встречались одинаково часто в основной и контрольной группах (табл. 2). Хламидофильные включения в трех типах клеток (эндотелиоцитах, эпителиоцитах и лейкоцитах) имели либо форму точек, либо форму округлых фигур (элементарные или ретикулярные тельца бактерий). При этом цитоморфологические свойства (а именно, размеры, форма цитоплазмы или ядер и т.п.) этих клеток не различались в зависимости от того, содержали они хламидофильные включения или нет.

Концентрации IgG и IgА были достоверно выше в основной, чем в контрольной группе, однако при этом доля пациентов с диагностически значимыми концентрациями антител существенно не различалась (табл. 2).

ТАБЛИЦА 2. Лабораторные признаки инфекции, вызванной Chlamydophila pneumoniae, у больных коронарным атеросклерозом и в контрольной группе
Основная группа Контрольная группа p
Примечание: *критерий χ2 Пирсона, ** U-критерий Манна–Уитни. В контрольной группе внутрисосудистая биопсия не выполнялась
Хламидофильные включения, % (n/N)
   эпителиоциты слизистой оболочки носовых ходов 52 (33/63) 31 (11/35) 0,045*
   лейкоциты крови 65 (41/63) 62 (21/34) 0,75*
   эндотелиоциты коронарных артерий, пораженных атеросклерозом 51 (32/63) - -
IgG в крови, усл. ед./мл 146,5 (54; 240) 97 (29,5; 154,5) 0,046**
IgA в крови, усл. ед./мл 40 (18; 75) 14 (0; 60) 0,027**
Диагностически значимые концентрации IgG в крови, % (n/N) 87 (47/54) 75 (18/24) 0,32
Диагностически значимые концентрации IgA в крови, % (n/N) 57 (31/54) 46 (11/24) 0,34
Количество лейкоцитов в крови, ×109/ 7,9 (6,8; 10,2) 6,7 (1,7) 0,0005**

Для дальнейшего анализа результатов больные основной группы были распределены на 2 подгруппы в зависимости от наличия у них в эндотелии коронарных артерий включений Cpn – феномен контаминации эндотелия (КЭ). В подгруппе больных с контаминацией коронарных эндотелиоцитов включения значительно чаще обнаруживалась и в эпителиоцитах слизистой оболочки носа (по сравнению с контрольной группой), а также в лейкоцитах крови (по сравнению с подгруппой больных без КЭ). Кроме того, концентрации IgG и IgA в подгруппе пациентов с КЭ были значительно выше, чем в контрольной группе, однако достоверно не отличались от таковых в подгруппе больных без КЭ (табл. 3).

ТАБЛИЦА 3. Лабораторные признаки инфекции, вызванной Chlamydophila pneumoniae, содержание лейкоцитов в крови и во внутрисосудистых биоптатах у больных коронарным атеросклерозом в зависимости от контаминации эндотелиоцитов хламидофилам
Основная группа Контрольная группа (3) P1-2 P1-3 P2-3
КЭ+ (1) КЭ+ (2)
Примечание: *критерий χ2 Пирсона, **U-критерий Манна–Уитни, ***t-критерий Стьюдента. В контрольной группе внутрисосудистая биопсия не выполнялась
Хламидофильные включения, % (n/N)
   эпителиоциты слизистой оболочки носовых ходов 59 (19/32) 45 (14/31) 31 (11/35) 0,26* 0,02* 0,25*
   лейкоциты крови 78 (25/32) 52 (16/31) 60 (21/34) 0,03* 0,15* 0,4*
IgG в крови, усл. ед./мл 184 (120,7) 120 (50;220) 97 (30;155) 0,11** 0,02** 0,23**
IgA в крови, усл. ед./мл 50 (18;97) 30 (18;50) 14 (0;60) 0,08** 0,01** 0,2**
Диагностически значимые концентрации IgG в крови, % (n/N) 89 (24/27) 85 (23/27) 75 (18/24) 1* 0,35* 0,57*
Диагностически значимые концентрации IgA в крови, % (n/N) 67 (18/27) 48 (13/27) 46 (11/24) 0,27* 0,22* 0,87*
Лейкоциты в биоптатах коронарных артерий, шт. 381 (0;833) 0 (0;360) - 0,04 - -
Лейкоциты в крови, ×109 7,9 (7,0;9,7) 8,5 (3) 6,7 (1,7) 0,7** 0,0007* 0,01**

При анализе клеточного состава интракоронарных биоптатов сложилось впечатление, что лейкоциты тропны к контаминированному эндотелию. Во внутрисосудистых биоптатах больных с КЭ лейкоцитов было больше, чем в биоптатах больных без КЭ. Количество лейкоцитов в биоптатах коррелировало, хотя и слабо (r=0,24; p=0,009), с наличием хламидофильных включений в эндотелиоцитах (табл. 3). Кроме того, концентрация лейкоцитов в периферической крови у больных с КЭ была значительно выше, чем в контрольной группе, хотя существенно не отличалась от таковой в подгруппе пациентов без КЭ (табл. 3).

Обсуждение

К отдельному виду бактерия Chlamydophila pneumoniae была отнесена относительно недавно, лишь в 1986 году. Вскоре была отмечена связь этого возбудителя со вспышкой в одном из воинских коллективов армии Финляндии острого респираторного заболевания, особенностью которого стало развитие осложнений – стенокардии и даже инфаркта миокарда у молодых военнослужащих. Затем были получены серологические подтверждения ассоциации Cpn-инфекции с острыми и хроническими формами ИБС, в том числе и в крупном проспективном исследовании Helsinki Heart Study [5,6]. К настоящему времени накоплено много данных, подтверждающих и объясняющих возможную связь инфекции с возникновением и прогрессированием атеросклероза. Они обобщены в ряде крупных обзоров [1,2,7].

Cpn распространена повсеместно. На протяжении жизни этим возбудителем заражаются (зачастую повторно) большинство людей. Серологические признаки инфекции обнаруживают примерно у половины жителей Северного полушария [8], чему вполне соответствуют показатели, отмеченные в контрольной группе данного исследования.

Считается, что острая Cpn-инфекция чаще протекает в бессимптомных или малосимптомных клинических формах респираторных заболеваний [8,9]. Клиничес кими проявлениями хронической Cpn-инфекции верхних дыхательных путей могут быть фарингит, риносинусит и полипоз носа [14,15]. К числу возможных проявлений хронической Cpn-ин фекции и ассоциированных с ней патологических состояний нижних дыхательных путей некоторые исследователи, находя Cpn в локальных субстратах, относят хронический бронхит, хроническую обструктивную болезнь легких и бронхиальную астму [12,13].

В то же время данные о частоте контаминации бактериями Cpn эпителиальных клеток дыхательных путей, в частности носа, у людей без явных симптомов респираторных заболеваний немногочисленны [16]. Полу ченные нами результаты свидетельствуют о том, что внутриклеточные включения Cpn в цилиндрическом эпителии носа — это довольно частое явление, даже у практических здоровых людей. Это относится и к присутствию данной бактерии в лейкоцитах периферической крови, которое обнаруживается у значительной пациентов в контрольных выборках [10,11], что нашло подтверждение и в результатах нашего исследования.

Уникальным результатом настоящей работы стало прижизненное обнаружение у половины больных ИБС включений бактерии Cpn в эндотелиоцитах из участков пораженных атеросклерозом коронарных артерий. Столь частое присутствие бактерий внутри клеток артерий, не относящихся ни к респираторному тракту, ни к циркулирующей крови, может вызывать и недоумение, и сомнение. Тем не менее, присутствие хламидофил в атеромах, иссеченных при аутопсии или хирургических вмешательствах, ранее было подтверждено во многих исследованиях и при использовании разных методов выявления Cpn. Обобщение данных, представленных в 43 публикациях на эту тему, показывает, что Cpn обнаруживается в 46% образцов материала из артерий, пораженных атеросклерозом, и лишь в 1% материала интактных артерий [7].

Идентификация Cpn методом непрямой иммунофлюоресценции могла бы быть отнесена и на счет возможного сходства (мимикрии) микробных и нативных молекул. Мимикрия действительно существует и может влиять на формирование иммунной реакции [2]. Однако принадлежность включений к жизнеспособным микроорганизмам Cpn была многократно доказана выделением их и последующим культивированием [1719]. Это является важнейшим постулатом Роберта Коха, подтверждающим этиологическую роль бактерии. В данной работе использовались видоспецифические моноклональные антитела, что обеспечивает высокую надежность (специфичность) выявления микробных включений. Кроме того, обращает на себя внимание вариабельность размеров и формы этих включений, что может косвенно свидетельствовать о репродукции бактерий в цитоплазме эндотелиоцитов [9].

Результаты настоящего исследования показывают, что контаминация клеток верхних дыхательных путей и крови, а также диагностически значимые титры антихламидийных антител являются частым явлением у практически здоровых людей. Чаще контаминация клеток слизистой носовых ходов и крови встречалась у больных коронарным атеросклерозом, что совпадает с данными других исследований [1,20]. Полученные нами данные в совокупности с результатами других исследований позволяют заключить, что контаминация Cpn верхних дыхательных путей, крови, эндотелия коронарных артерий является одним из проявлений хронической персистирующей генерализованной инфекции. Кроме того, эта инфекция более свойственна больным атеросклерозом, а именно коронарной болезнью сердца.

Возможности распознавания Cpn-инфекции, в том числе ее топической диагностики, расширились благодаря выявлению бактерий в очагах поражения коронарных артерий при помощи внутрисосудистой биопсии, которая позволяет также отчасти оценивать локальное воспаление, основываясь на подсчете лейкоцитов во внутрисосудистых биоптатах.

Вопросы предотвращения, подавления и эрадикации хламидофильной инфекции у больных атеросклерозом остаются открытыми. В некоторых экспериментальных исследованиях и единственном крупном клиническом испытании (CLARIFY) показано благоприятное влияние антибактериального лечения на течение атеро склероза, однако другие попытки применения антибактериальных средств для профилактики и ле че ния в рамках клинических исследованиях оказались безуспешными [1,2]. Тем временем ведутся разработки антихламидийных вакцин, что является одним из развивающихся направлений – вакцинопрофилактики атеросклероза [1,2].

Более точное понимание патогенеза инфекционного процесса, вызванного Cpn, как хронического генерализованного заболевания, включающего поражение сосудов, и применение совершенствующихся методов диагностики оставляют надежду на успешное решение проблемы профилактики и лечения инфицирования бактерией Chlamydophila pneumoniae в будущем, а вместе с ней и проблемы профилактики и лечения атеросклероза, ассоциированного с данной инфекцией.

Используемые источники

  1. Campbell LA, Rosenfeld ME. Infection and atherosclerosis development. Arch Med Res 2015;46(5):339-50.
  2. Pothineni NVK, Subramany S, Kuriakose K, et al. Infections, atherosclerosis, and coronary heart disease. Eur Heart J 2017;38(43):3195-201.
  3. Тарасов А.В., Кравцов В.Ю., Хирманов В.Н. и др. Клетки эндотелия атеро- склеротически измен нных коронарных артерий, полученные при аншио- ённых коронарных артерий, полученные при аншио- пластике (внутрисосудистой биопсии). Цитология 2018;60(3):173-9.
  4. Тарасов А.В., Кравцов В.Ю., Хирманов В.Н. Способ получения клеток и неклеточных элементов атеросклеротической бляшки. Патент России №24 ДЗ г. Москвы 2013144312A. 2013.
  5. Saikku P, Leinonen M, Mattila K, et al. Serological evidence of an association of a novel Chlamydia, TWAR, with chronic coronary heart disease and acute myocardial infarction. Lancet 1988;2:983-86.
  6. Saikku P, Leinonen M, Tenkanen L, et al. Chronic Chlamydia pneumoniae infec- tion as a risk factor for coronary heart disease in the Helsinki Heart Study. Ann Intern Med 1992;116(4):273–8.
  7. Kalayoglu MV, Libby P, Byrne GI. Chlamydia pneumoniae as an emerging risk factor in cardiovascular disease. JAMA 2002;288(21):2724-31.
  8. Stassen FR, Vainas T, Bruggeman CA. Infection and atherosclerosis. An alterna- tive view on an outdated hypothesis. Pharmacol Rep 2008;60(1):85-92.
  9. Лобзин Ю.В., Позняк А.Л., Сидорчук С.Н. Хламидийные инфекции. СПб: Фолиант, 2010, 488 с.
  10. Kaul R, Uphoff J, Wiedeman J, et al. Detection of Chlamydia pneumonia e DNA in CD3+ lymphocytes from healthy blood donors and patients with coronary artery disease. Circulation 2000;102(19):2341-6.
  11. Boman J, Söderberg S, Forsberg J, et al. High prevalence of Chlamydia pneumo- niae DNA in peripheral blood mononuclear cells in patients with cardiovascular disease and in middle-aged blood donors. J Infect Dis 1998;178(1):274-7.
  12. Black PN, Scicchitano R, Jenkins CR, et al. Serological evidence of infection with Chlamydia pneumoniae is related to the severity of asthma. Eur Respir J 2000;15(2):254-9.
  13. Park SJ, Lee YC, Rhee YK, Lee HB. Seroprevalence of Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia pneumoniae in stable asthma and chronic obstructive pulmonary disease. J Korean Med Sci 2005;20(2):225-8.
  14. Edvinsson M, Asplund MS, Hjelm E, Nyström-Rosander C. Chlamydophila pneu- moniae in chronic rhinosinusitis. Acta Otolaryngol 2006;126(9):952-7.
  15. Apan TZ, Alpay D, Alpay Y. The possible association of Chlamydia pneumoniae infection with nasal polyps. Eur Arch Otorhinolaryngol 2007;264(1):27-31.
  16. Позняк А.Л., Пониделко С.Н. Поражения ЛОР-органов у больных уроге- ниатальными хламидиазами с системными проявлениями. Новости отори- ноларингологии и логопатологии 2001;1:35-9.
  17. Ramirez JA. Isolation of Chlamydia pneumoniae from the coronary artery of a patient with coronary atherosclerosis. The Chlamydia pneumoniae /Atherosclerosis Study Group. Ann Intern Med 1996;125(12):979-82.
  18. Jackson LA, Campbell LA, Kuo CC, et al. Isolation of Chlamydia pneumoniae from a carotid endarterectomy specimen. J Infect Dis 1997;176(1):292–5.
  19. Maass M, Bartels C, Engel PM, et al.. Endovascular presence of viable Chlamydia pneumoniae is a common phenomenon in coronary artery disease. J Am Coll Cardiol 1998;31(4):827–32.
  20. Agarwal A, Chander Y, Nagendra A. Serological evidence of chronic Chlamydia pneumoniae infection in coronary artery disease. Med J Armed Forces India 2007;63(3):229-32.

Версия на английском языке