Индивидуальная изменчивость лекарственного ответа является одной из основных проблем в современной клинической практике [1-2]. Ферменты цитохрома P-450 (P-450) являются основными участниками метаболизма ксенобиотиков. Генетическая изменчивость генов, кодирующих данные ферменты, играет важную роль в проявлении индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам [3]. Одним из основных изоферментов Р-450 является CYP2C19, который участвует в метаболизме целого ряда лекарственных препаратов: ингибиторов протонной помпы (омепразол, панторазол, лансопразол, рабепразол и эзомепразол), антидепрессантов (трициклические антидепрессанты – амитриптилин, кломипрамин, имипрамин, селективные ингибиторы обратного захвата серотонина – циталопрам, ингибитор МАО – моклобемид), противоэпилептических средств (диазепам, фенитоин, фенобарбитал, клоназепам), нестероидных противовоспалительных препаратов (диклофенак, индометацин), антикоагулянтов (варфарин), антиагрегантов (тиенопиридины, в том числе клопидогрел), противогрибковых препаратов (вориконазол), b-адреноблокаторов (пропранолол), противоопухолевых (циклофосфамид) и других лекарственных средств [4-5]. Лекарственные взаимодействия являются ведущей причиной снижения или полного отсутствия эффекта терапии и побочных лекарственных реакций. Большинство лекарственных взаимодействий отмечается в результате конкурентного ингибирования, при котором два вещества конкурируют друг с другом за один участок связывания с изоферментом Р450 [6,7].
Клопидогрел – пролекарство, которое превращается в активный метаболит и избирательно необратимо блокирует АДФ-зависимую активацию и агрегацию тромбоцитов. После кишечной абсорбции, осуществляемой с помощью белкового транспортера – гликопротеинаР, детерминированного геном ABCB1, большая часть (85%) пролекарства метаболизируется и инактивируется эстеразами, и только оставшиеся 15% клопидогрела превращаются в промежуточный метаболит 2-оксо-клопидогрел. Этот неактивный метаболит далее гидролизуется в высоко нестабильное производное активного тиола R-130964 путем воздействия изоферментов CYP2C19, кодируемых геном CYP2C19 [8,9].
Поли морфная изменчивость этого гена определяет разную ферментативную активность изофермента CYP2C19 и, соответственно, наличие в популяции медленных, промежуточных, быстрых и ультрабыстрых метаболизаторов ксенобиотиков [10]. Аллельный вариант CYP2C19*1 определяет стандартную ферментативную активность CYP2C19. CYP2C19*2 и *3 являются основными причинами сниженного метаболизма лекарственных средств, в том числе клопидогрела (медленные метаболизаторы). Носители полиморфизма CYP2C19*17, в зависимости от гомо- или гетерозиготного варианта носительства, относятся к быстрым или ультрабыстрым метаболизаторам ксенобиотиков [11]. Частота распределения полиморфизма CYP2C19 (CYP2C19*2, CYP2C19*3, CYP2C19*17) и ABCB1 зависит от этнической принадлежности и географической локализации популяции, что связано с историческим формированием населения на определенных территориях [12,13].
Целью исследования было сравнить частоту полиморфных маркеров CYP2C19 и ABCB1 у больных ишемическим инсультом (ИИ) и здоровых добровольцев и оценить влияние сопутствующей лекарственной терапии на эффективность клопидогрела у больных ИИ.
В исследование включали пациентов с диагнозом ИИ, который устанавливали на основании критериев классификации сосудистых заболеваний головного мозга [14]. Этническую принадлежность среди больных ИИ не определяли. Все участники дали добровольное информированное согласие на участие в исследовании, протокол которого был одобрен локальным этическим комитетом Иркутской областной клинической больницы (протокол №73 от 29 ноября 2016 г.). Все пациенты в первые 24 часа госпитализации или не ранее, чем через 24 часа после тромболитической терапии (алтеплаза) получали 0,125 г ацетилсалициловой кислоты, а затем клопидогрел в дозе 0,075 г/сут. В первые, седьмые и тринадцатые сутки определяли остаточную реактивность тромбоцитов (ОРТ) с использованием четырехканального светооптического агрегометра (Helena AggRAM, Великобритания) с добавлением в качестве индукторов агрегации тромбоцитов адреналина и аденозиндифосфата (АДФ).
Генотипирование выполнялось на базе Научно-исследовательского центра ГБОУ ДПО “Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования" Минздрава России (г. Москва), куда доставлялась цельная венозная кровь в вакуумных стеклянных пробирках с К3 этилендиаминтетраацетатом. Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) из лейкоцитов выделяли с помощью набора реагентов “ДНК-Экстран-1" (ЗАО “Синтол", Москва, Россия). Полиморфные маркеры генов CYP2C19*2 (G681A), CYP2C19*3 (G363A), CYP2C19*17 (C806T) и ABCB1 (C3435T) определяли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с помощью наборов реагентов “SNP-Скрин" (ЗАО “Синтол", Москва, Россия) на амплификаторе Real-Time CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). После предварительной денатурации при 95°С в течение 3 минут следовали 40 циклов: денатурация при 95°C в течение 15 с, отжиг при 63°C в течение 40 мин.
Статистическую обработку проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 и INSTAT. Для количественных переменных при нормальном распределении данных приведены средние значения и стандартные отклонения. Данные проверены на нормальность распределения и однородность дисперсных групп с использованием критериев Шапиро-Уилки или Колмогорова-Смирнова в зависимости от количества исследуемых. Статистически значимыми считали различия при р<0,05. Для подтверждения независимого распределения аллелей оценивали соответствие закону Харди–Вайнберга с использованием авторского калькулятора [Michael H. Court (2005-2008)]. Полученные результаты популяционного исследования соответствовали закону Харди–Вайнберга при значении р>0,05. Для оценки различий частоты полиморфных аллелей использовали точный тест Фишера и отношение шансов.
В исследование был включен 121 пациент, госпитализированный в региональный сосудистый центр Иркутской областной клинической больницы с диагнозом ИИ (82 мужчины и 39 женщин, средний возраст 61,6±7,7 года). В зависимости от изменения ОРТ на 13-е сутки терапии клопидогрелом больные ИИ были разделены на две группы. Первую составили 111 (91,7%) пациентов с “лабораторной" чувствительностью к клопидогрелу (ОРТ ≤65%), вторую – 10 (8,3%) пациентов с “лабораторной" резистентностью к клопидогрелу (ОРТ >65%).
В контрольную группу были включены 250 здоровых добровольцев – представителей двух наиболее многочисленных этнических групп, проживающих в Приангарье, в том числе 136 русских (26 мужчин и 110 женщин, средний возраст 42,1±12,0 лет) и 114 бурят (34 мужчины и 80 женщин, средний возраст 42,8±15,4 года).
Среди больных ИИ распределение по всем исследуемым генотипам соответствовало закону ХардиВайнберга: CYP2C19*2 (χ2,/=0,0001, р=0,99), CYP2C19*3 (χ2=0,03, р=0,85), CYP2C19*17 (χ2=0,96, р=0,33), ABCB1 (χ2=1,81, р=0,18). Среди здоровых добровольцев распределение по генотипам соответствовало закону Харди-Вайнберга по CYP2C19*2 (русские: χ2=0,025, p=0,87; буряты: χ2=1,90, p=0,17), CYP2C19*17 (русские: χ2=0,28, p=0,60; буряты: χ2=0,86, p=0,35), ABCB1 (русские: χ2=3,58, p=0,06; буряты: χ2=2,51, p=0,11).
При генотипирования популяции русских полиморфизм CYP2C19*3 не был выявлен, а рассчитать χ2 по Харди-Вайнбергу не представлялось возможным. Статисти чески значимых различий частоты CYP2C19*2 между русскими и бурятами не обнаружено: 15,4% и 16,2%, соответственно (р=0,807). В то же время CYP2C19*3 встречался только у бурят – 9,2% (р<0,0001), а CYP2C19*17 определялся чаще у русских – 26,8% и 6,1%, соответственно (р<0,0001).
Для гена ABCB1 статистически значимых различий между исследуемыми этническими группами не обнаружено: у русских частота Т-аллеля составила 48,9%, у бурят – 44,7% (р=0,369).
Генотип | Больные ИИ, n=121 | Здоровые, n=250 | p |
---|---|---|---|
CYP2C19*2, n (%) | |||
GG | 86 (71,1) | 175 (70,0) | 0,904 |
GA + AA | 35 (28,9) | 75 (30,0) | |
CYP2C19*3, n (%) | |||
GG | 117 (96,7) | 230 (92,0) | 0,114 |
GA + AA | 4 (3,3) | 20 (8,0) | |
CYP2C19*17, n (%) | |||
CC | 69 (57,0) | 175 (70,0) | 0,015 |
CT + TT | 52 (43,0) | 75 (30,0) | |
ABCB1, n (%) | |||
СС | 22 (18,0) | 69 (27,6) | 0,054 |
CT + TT | 98 (82,0) | 181 (72,4) |
Частота генотипов CYP2C19*2, CYP2C19*3, CYP2C19*17, ABCB1 была также сопоставлена у больных ИИ и всех здоровых добровольцев в целом. Частота CYP2C19*2 и CYP2C19*3 в двух группах не отличалась (табл. 1), в то время как по CYP2C19*17 и ABCB1 продемонстрированы статистически значимые различия частоты аллелей и генотипов: частота полиморфных маркеров CYP2C19*17 (CT + TT) и ABCB1 (CT + TT) была выше у больных ИИ – 43,0% и 30,0% (p=0,015) и 82,0% и 72,4% (p=0,054), соответственно.
Статистически значимое влияние на антитромбоцитарную активность клопидогрела у больных ИИ оказывали блокаторы кальциевых каналов, ингибиторы АПФ и статины (табл. 2).
Сопутствующая лекарственная терапия, n (%) |
Чувствительны к клопидогрелу (n=111) |
Резистентны к клопидогрелу (n = 10) |
p | ОШ | 95% ДИ |
---|---|---|---|---|---|
Примечание: ОШ – отношение шансов; ДИ – доверительный интервал; n – количество субъектов; ИПП – ингибиторы протонной помпы; ингибиторы АПФ - ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента | |||||
Тромболитическая терапия | 10(9,0) | 0 | 0,0064 | 20,869 | 1,197-363,89 |
Блокаторы кальциевых каналов | 68 (61,3) | 8 (80,0) | 0,0053 | 0,391 | 0,208–0,737 |
Бета-адреноблокаторы | 71 (64,0) | 7 (70,0) | 0,4521 | 0,762 | 0,422–1,376 |
ИПП | 109 (98,2) | 10 (100,0) | 0,4773 | 0,196 | 0,009–4,138 |
Ингибиторы АПФ | 103 (92,8) | 10 (100,0) | 0,0210 | 0,062 | 0,003–1,102 |
Статины | 100 (90,1) | 10 (100,0) | 0,0035 | 0,042 | 0,002–0,743 |
Сахароснижающие препараты | 23 (20,7) | 2 (20,0) | 0,8610 | 1,063 | 0,535–2,113 |
Таким образом, в нашем исследовании в русской популяции Приангарья выявлена более высокая частота полиморфного маркера CYP2C19*2, который ассоциируется со снижением фармакологического ответа на стандартные дозы клопидогрела. В популяции бурят, проживающих на той же территории, определялось носительство полиморфизма CYP2C19*3, который также приводит к снижению активности клопидогрела. Кроме того, у русских и бурят была высокой частота CYP2C19*17, наличие которого может указывать на высокий риск геморрагических осложнений на фоне применения клопидогрела.
По данным разных исследователей, CYP2C19*2 встречается у 18-75% представителей монголоидной расы [16-18] и 13-93% – европеоидной [18,19]. Обращает на себя внимание зависимость частоты CYP2C19*3 от этнической принадлежности: если у монголоидов она составляет 0,5-25% [17-18], то у европеоидов – менее 1% [18-20]. На территории Российской Федерации изучена распространенность CYP2C19*2 и CYP2C19*3 в разных этнических группах: частота CYP2C19*2 у якутов составила 23%, у бурят – 21%, у алтайцев и тувинцев – по 15%; частота CYP2C19*3 у якутов – 5%, у бурят – 7%, у алтайцев – 4%, у тувинцев – 2% [13,21]. Частота носительства аллельных вариантов CYP2C19*17 у европеоидов составляет в среднем 2042%, у монголоидов – 1-14% [18,19]. Сопо ставимая частота полиморфных вариантов гена ABCB1 выявлена среди европеоидов и монголоидов – 24-50% [19,21,22] и 50%, соответственно [19,22].
В крупном исследовании у русских пациентов с острым коронарным синдромом из разных регионов России была изучена частота аллельных вариантов CYP2C19*2, CYP2C19*3 и CYP2C19*17. Она составила в Северной Сибири 14,9, 0,5 и 33,3%, соответственно, в Центральной Сибири – 11,1, 0,0 и 17,1%, в Восточной Сибири – 10,6, 2,9 и 22,2%, в Московской области – 8,0, 0,0 и 15,4%. Различия частоты “медленных" и “быстрых" аллельных вариантов гена CYP2C19 выявлены между пациентами из отдаленных друг от друга регионов (Центральной и Восточной Сибири) по
CYP2C19*3 (р=0,001) [12]. Другие исследователи показали, что частота “медленной" аллели CYP2C19*2 (*1/*2) в русской популяции Восточной Сибири составила 22,5%, при этом носителей гомозиготного генотипа (*2/*2) не выявлено, что, возможно, связано с малым объемом выборки [23].
Антитромботическая активность клопидогрела зависит от генетических (носительство полиморфизма генов системы цитохрома Р-450 и гликопротеина Р) и негенетических факторов (демографические, курение, диета, применение других лекарственных препаратов) [24]. Тромболитическая терапия в первые часы госпитализации, которую получали 10 (8,3%) больных ИИ, достоверно усиливала антитромбоцитарную активность клопидогрела. Сходные данные получили М.Э. Гафа рова и соавт. [25]. В другом отечественном иссле довании установлена связь между исходами тромболитической терапии у больных ИИ и функциональными характеристиками тромбоцитов [26].
В нашем исследовании 80% больных ИИ с лабораторной резистентностью к клопидогрелу получали блокаторы кальциевых каналов (p=0,0053). Негативное влияние препаратов этой группы на снижение ОРТ было ранее выявлено в 6-месячном проспективном исследовании эффективности клопидогрела у 200 пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС), перенесших чрескожное коронарное вмешательство (ЧКВ). Это исследование продемонстрировало снижение степени ингибирования тромбоцитов клопидогрелом у 40% пациентов, принимавших блокаторы кальциевых каналов (p=0,008), в результате конкурентного влияния на изофермент CYP3A4. Прием блокаторов кальциевых каналов оставался независимым предиктором снижения эффективности клопидогрела после внесения поправки на наличие сердечно-сосудистых факторов риска. У пациентов, получавших эти препараты, АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов была на 30% выше, чем у больных, которым не назначали блокаторы кальциевых каналов (p=0,046). Кроме того, прием блокаторов кальциевых каналов ассоциировался с неблагоприятным клиническим исходом (смертью от сердечно-сосудистых причин, нефатальным инфарктом миокарда, тромбозом стента) [27]. В нашем исследовании все больные ИИ с лабораторной резистентностью к клопидогрелу получали ингибиторы АПФ (p=0,021). D. Skowasch и др. в клиническом исследовании у 320 больных ИБС и/или артериальной гипертонией, показали, что агрегация тромбоцитов снижалась при лечении каптоприлом на 46% (p<0,05). Кроме того, наблюдалась тенденция к ингибированию функции тромбоцитов при применении рамиприла, в то время как эналаприл не оказывал влияния на тромбоциты [28]. Однако в 10-летнем ретроспективном исследовании (2003-2013 гг.), в котором изучалось влияние ингибиторов АПФ на эффективность клопидогрела после инфаркта миокарда почти у 46 000 пациентов, не были подтверждены клиническое значение данного лекарственного взаимодействия и влияние ингибиторов АПФ на функцию тромбоцитов [29]. Другие авторы указывают на повышенный риск геморрагических осложнений при совместном применении клопидогрела и ингибиторов АПФ, так как большая часть клопидогрела, как и большинства ингибиторов АПФ, гидролизуется до неактивного метаболита печеночной карбоксилэстеразой 1 (CES1). Вследствие конкуренции за CES1 образуется большое количество активного метаболита клопидогрела. У 70 934 пациентов с инфарктом миокарда, получавших лечение ингибиторами АПФ совместно с клопидогрелом или без него, было выявлено статистически значимое увеличение риска развития кровотечений на фоне одновременного приема клопидогрела [30].
Применение гиполипидемических препаратов сов местно с клопидогрелом сопровождалось снижением чувствительности тромбоцитов к клопидогрелу: частота применения статинов в группах пациентов с резистентностью и чувствительностью к клопидогрелу составила 100% и 90,1%, соответственно (р=0,0035). Некоторые исследования показали, что липофильные статины (аторвастатин, ловастатин и симвастатин) могут конкурентно ингибировать CYP3A4 и уменьшать образование активного метаболита клопидогрела, снижая тем самым антитромботическую активность клопидогрела [31,32]. Напротив, другие исследования не смогли подтвердить эти выводы [27,33].
По данным систематического анализа, в 7 из 10 исследований, в которых изучались фармакокинетика и фармакодинамика клопидогрела у здоровых добровольцев, добавление ингибиторов протонной помпы (ИПП) приводило к выраженному снижению ингибирования тромбоцитов [34]. При одновременном применении клопидогрела и ИПП, главным образом, омепразола и эзомепразола, подавляется образование активного метаболита клопидогрела и уменьшается его антитромботическая активность, так как ИПП являются мощными ингибиторами изоферментов CYP2C19 и CYP3A4 [35]. Это приводит к увеличению риска тромботических осложнений и сердечно-сосудистых событий [36]. В то же время пантопразол не влиял на антитромботическую активность клопидогрела, что продемонстрировано в исследовании у 13 636 больных. В этом исследовании сочетанная терапия двумя препаратами не сопровождалась повышением риска развития повторного инфаркта миокарда (отношение шансов 1,02, 95% доверительный интервал [ДИ] 0,70–1,47) [37]. Наименьшим влиянием на изоферменты CYP2C19 обладают пантопразол и рабепразол, что объясняется низкой аффинностью этих препаратов к системе Р-450 [38,39].
Учитывая особенности распространения значимых полиморфных маркеров Р-450 (CYP2C19*2, CYP2C19*3, CYP2C19*17 и ABCB1) в различных географических зонах с исторически сложившимися особенностями формирования населения, уровня здоровья популяции, распространения факторов риска инсульта, персонализированный подход к профилактике и лечению сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе ИИ, имеетважное значение. В настоящее время опубликованы рекомендации Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium (CPIC) и Dutch Pharmacogenetics Working Group (DPWG) по применению фармакогенетического тестирования по гену CYP2C19 для персонализированного назначения клопидогрела. В отношении тестирования гена ABCB1 таких клинических рекомендаций пока нет [40]. Крайне важным в персонализированном подходе был и остается учет межлекарственного взаимодействия, характеризующегося антагонизмом или синергизмом лекарственных средств, которые приводят к снижению эффективности терапии или увеличению частоты нежелательных побочных реакций [21]. Таким образом, антиагрегантная терапия, в том числе клопидогрелом, у больных ИИ требует тщательной оценки всех генетических и негенетических факторов риска [8].
Хотя наше исследование имело ограниченный размер выборки, его результаты могут представлять интерес для практической медицины. Необходимы дальнейшие исследования для подробного изучения факторов, влияющих на эффективность клопидогрела.