Активация системы комплемента при АНЦА-ассоциированных васкулитах

Материал и методы

В исследование включали пациентов с впервые диагностированным ААВ или рецидивом заболевания. Диагноз ГПА и МПА устанавливали в соответствии с критериями Американской коллегии ревматологов (АКР, 1990 г.) [11], алгоритмом Европейского агентства по лекарствам (EMA) [12] и определением, принятом на конференции в ЧапелХилле в 2012 г. [13]. Для оценки активности ААВ использовали Бирмингемский индекс активности васкулита (BVAS, v.3). Критерием включения было значение этого индекса по крайней мере 3 балла. Контрольную группу составили здоровые добровольцы, которых набирали в Клинике им. Е.М. Тареева Первого МГМУ им. И.М. Сеченова и Вла димирской областной клинической больнице. Все участники исследования дали письменное информированное согласие, одобренное локальным этическим комитетом Первого МГМУ им. Сеченова. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией.

Биопсию почек оценивали в соответствии со стандартным протоколом [14]. Класс АНЦА-ассоциированного гломерулонефрита устанавливали согласно классификации Бердена [15]. Рассчитывали процент клубочков с полулуниями и полностью склерозированных клубочков от общего количества клубочков, полученных при биопсии. Оценивали также степень интерстициального фиброза и канальцевой атрофии и отложение IgA, IgG, IgM, C3 и легких цепей каппа и лямбда.

Концентрацию компонентов комплемента в плазме крови определяли с помощью иммуноферментного анализа: C5b-9 (HK328-02, Hycult Biotech, Нидерланды), C5a (HK349-01, Hycult Biotech, Нидерланды), C3a (HK354-01, Hycult Biotech, Нидерланды), фактор B (EF7001-1, ASSAYPRO, США) и пропердин (фактор P; SEA783Hu, CloudClone Corporation, США). Лабораторный анализ прово дился в соответствии с инструкциями производителя. Верхняя граница нормы (97,5-й процентиль) для каждого компонента комплемента была определена после анализа результатов исследования в контрольной группе. Верхняя граница нормального содержания С5b-9 составила 11271,1 mAU/мл, С5а – 33,1 нг/мл, С3а – 8955,3 нг/мл, фактора В – 2864,1 мкг/мл, а нижняя граница нормального содержания пропердина – 357,8 мкг/мл.

Статистический анализ проводился с использованием программы IBM SPSS Statistics версии 23.0. Нормальность распределения тестировали при помощи критерия Шапиро-Уилка. Данные для количественных показателей с нормальным распределением представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения (М±m). Данные для количественных показателей с распределением, отличавшимся от нормального, приведены в виде медианы и межквартильного размаха. Данные для показателей с номинальным (качественным) типом шкалы представлены в виде абсолютных частот и доли в группе в процентах. Оценку значимости различий при отклонении распределения от нормального в группах для независимых количественных переменных проводили при помощи критерия Манна-Уитни, для связанных количественных переменных – при помощи критерия Уилкоксона. Корреляционный анализ порядковых и количественных данных проводили с использованием коэффициента корреляции Спирмена. Значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты

Демографические и клинические показатели. В проспективное исследование были включены 59 пациентов с ГПА (n=41) или МПА (n=18) (табл. 1). У 6 пациентов с АНЦА-негативным ААВ диагноз локальной формы ГПА был подтвержден при гистологическом исследовании. У 35 пациентов диагноз ААВ был установлен впервые, в то время как у 24 больных имелся рецидив заболевания. Двадцать три из 35 больных с впервые диагностированным ААВ поступили в клинику и были включены в исследование через 4-6 недель после начала иммуносупрессивной терапии в амбулаторных условиях (2-3 инфузии циклофосфамида с высокими дозами глюкокортикоидов), тогда как 12 пациентов не получали какие-либо иммуносупрессивные препараты до взятия анализов. Все 24 пациента с рецидивом ААВ были обследованы на фоне поддерживающей иммуносупрессивной терапии. Следует отметить, что несмотря на лечение иммуносупрессивными препаратами у всех пациентов на момент исследования компонентов комплемента имелась высокая активность ААВ: величина индекса BVAS варьировалась от 3 до 31 балла, а медиана составляла 16,5 балла.

У 28 пациентов анализы были взяты повторно во время ремиссии ААВ, достигнутой через 3–38 мес (медиана 16 мес) после начала иммуносупрессивного лечения ритуксимабом (n=4), циклофосфамидом (n=20), метотрексатом (n=3) или мофетила микофенолатом (n=1).

Контрольную группу составили 36 здоровых добровольцев, в том числе 9 мужчин и 27 женщин, средний возраст 55,7±12,4 года.

С5b-9, C5a, C3a, факторы B и P (пропердин) у пациентов с активным ААВ. У пациентов с активным ААВ медианы концентраций С5b-9, C5a, C3a и фактора B были выше, чем в контрольной группе (p<0,001; табл. 2). Медиана концентрации пропердина была ниже у пациентов с AAВ, однако разница между группами не достигла статистической значимости. Концентрации С5B-9, C5a, C3a и фактора B превышали верхние границы у 50 (84,7%), 15 (25,4%), 49 (83,1%) и 8 (13,6%) пациентов, соответственно, тогда как уровень пропердина был снижен у 13 (22,0%) пациентов.

У 28 пациентов с AAВ мы определили уровни компонентов комплемента до и после индукции ремиссии. Достижение ремиссии сопровождалось значительным снижением уровней С3а с 21436,0 до 11811,0 нг/мл (р=0,005), С5а с 21,6 до 18,8 нг/мл (р=0,035) и фактора B с 1804,0 до 1480,0 мкг/мл (р=0,045), в то время как уровни C5b-9 и пропердина не изменились (табл. 2).

Нормализация уровня C5a была достигнута у 5 (62,5%) из 8 пациентов, С3а – у 11 (44,0%) из 25 пациентов, С5b-9 – у 6 (25,0%) из 24 пациентов, фактора В – у 6 (100%) пациентов. Уровень пропердина у всех 28 пациентов, обследованных в динамике, был нормальным как исходно, так и после индукционной терапии. У нескольких пациентов наблюдалось увеличение уровней компонентов комплемента во время проведения иммуносупрессивной терапии, включая C3a у 2 пациентов, С5b-9 у 3 пациентов и фактора B у 1 пациента.

Зависимость уровней комплемента от типа АНЦА, особенностей течения и длительности заболевания, а также предшествующей иммуносупрессии. Мы не обнаружили различий в уровнях С5b-9, C5a, C3a, фактора B и пропердина между пациентами с ПР3-AНЦА или MПO-АНЦА (табл. 3), с ГПА или MПА (табл. 4), с впервые диагностированным AAВ или рецидивом заболевания (табл. 5), а также между пациентами, получавшими и не получавшими иммуносупрессивную терапию (табл. 6).

Мы также сопоставили уровни компонентов системы комплемента у пациентов с различными фенотипами ААВ, в том числе “нетяжелым", “тяжелым ПР3-AНЦАположительным" и “тяжелым MПО-AНЦА-положительным" васкулитом [16]. Первый вариант (обычно ПР3-AНЦА-положительный или иногда AНЦА-отрицательный) характеризуется наличием гранулематозного воспаления (поражение ЛОР-органов, очаговые или инфильтративные изменения в легких, ретроорбитальная опухоль и/или пахименингит) без жизне- или органоугрожающих состояний. Проявлениями “тяжелого" васкулита считали гломерулонефрит, альвеолярное кровотечение, множественный мононеврит и склерит. Медианы уровней всех исследуемых компонентов комплемента были одинаковыми в этих группах пациентов.

Кроме того, мы разделили пациентов на две группы в зависимости от тяжести заболевания, которую оценивали на основании наличия крайней мере одного большого критерия BVAS и общего индекса BVAS >6. Медианы BVAS у пациентов с тяжелой и нетяжелой формами AAВ составили 15 (13; 16) и 8 (6; 9), соответственно. Уровни компонентов комплемента не отличались у пациентов с “тяжелым" и “нетяжелым" ААВ.

Корреляция уровней компонентов комплемента с лабораторными параметрами и результатами биопсии почки. У 59 пациентов с активным AAВ уровни C5a коррелировали с уровнями C3a (r = 0,371, p = 0,004), С5b-9 (r = 0,355, p = 0,006) и фактором B (r = 0,281, p = 0,031). Однако нами не было выявлено связи между уровнями компонентов комплемента и индексом BVAS, суточной протеинурией, сывороточным креатинином, концентрацией C-реактивного белка или СОЭ. У 13 пациентов, которым была выполнена биопсия почки, уровень фактора B коррелировал с отложением C3 в клубочках (r = 0,648, p = 0,023), тогда как связи между уровнями остальных компонентов комплемента и гистологическими параметрами были статистической незначимыми.

Обсуждение

При активации всех трех путей системы комплемента происходит образование С3-конвертазы, которая расщепляет С3 на анафилотоксин С3а и опсонин С3b [18]. Взаимодействие C3b с C3-конвертазой приводит к образованию C5-конвертазы, расщепляющей C5 на анафилотоксины C5a и C5b, которые запускают каскад реакций, приводящих к образованию C5b-9 (мембраноатакующего комплекса). В нашем исследовании, как и в предыдущих работах, уровни С5а и С5b-9 были повышены у пациентов с активным AAВ по сравнению со здоровыми добровольцами. Эти данные указывают на то, что при развитии системного васкулита происходит активация системы комплемента. У наших пациентов индукционная иммуносупрессивная терапия привела к снижению уровня C5a, в то время как уровни С5b-9 не изменились. Индукционная терапия вызывала также снижение уровня C3a

Активация комплемента при AAВ не зависела от типа АНЦА, тяжести заболевания или предшествующей иммуносупрессии, так как мы не обнаружили различий уровней C5a и С5b-9 между группами пациентов с различными типами АНЦА (MПО-АНЦА или ПР3АНЦА), нозологическими формами ААВ (МПА или ГПА), впервые диагностированным ААВ или рецидивом ААВ, а также между пациентами, получавшими или не получавшими иммуносупрессивную терапию до включения в исследование.

Уровни C5a и С5b-9 не корреливали с величиной индекса BVAS, протеинурией, сывороточным уровнем креатинина или лабораторными маркерами воспаления и были повышены только у части пациентов с активным AAВ. Следует отметить, что концентрация C5a превышала верхнюю границу только у четверти пациентов с клинические проявлениями активного AAВ. Таким образом, повышение уровней С5а и C5b-9 не позволяет надежно оценить наличие активности ААВ.

Мы также измеряли уровни фактора B и пропердина, которые являются компонентами альтернативного пути активации комплемента. Фактор B расщепляется фактором D на Ba и Bb и необходим для образования C3конвертазы альтернативного пути (C3bBb), тогда как пропердин увеличивает период полувыведения активности конвертазы и способствует постоянному расщеплению C3 до C3a и C3b. Средние уровни фактора B были повышены у пациентов с активным AAВ по сравнению со здоровыми добровольцами и снизились после достижения ремиссии системного васкулита. В то же время мы не обнаружили достоверных различий между средними уровнями пропердина у пациентов с AAВ и здоровых добровольцев.

Накопление фактора Bb в почечных клубочках пациентов с AAВ коррелировало с процентом полулуний, степенью инфильтрации интерстиция, интерстициальным фиброзом и канальцевой атрофией и было обратно пропорционально доле нормальных клубочков [19]. Кроме того, концентрация Bb в плазме крови коррелировала с уровнями C3a, C5a и С5b-9, клиническими и лабораторными признаками активности васкулита (индекс BVAS, СОЭ), а также долей полулуний в почечных биоптатах [8]. Эти данные указывают на то, что уровни циркулирующего Bb могут отражать активность поражения почек при AAВ. При анализе 187 биоптатов почки у пациентов с AAВ отложение пропердина коррелировало с процентом полулуний, а уровень пропердина сыворотки крови коррелировал с протеинурией [5]. В нашем исследовании уровни фактора B или пропердина не коррелировали с протеинурией, креатинином сыворотки, BVAS или лабораторными маркерами воспаления (СОЭ, С-реактивный белок). В небольшой группе пациентов, которым была выполнена биопсия почки, уровни фактора B коррелировали с отложением C3 в клубочках, тогда как все остальные связи между компонентами комплемента и гистологическими параметрами не были достоверно значимыми.

Изучение роли системы комплемента в патогенезе AAВ открывает новые возможности терапии этой группы заболеваний. К сожалению, в настоящее время смертность от осложнений иммуносупрессивнои терапии при ААВ сопоставима с таковой от проявлений самого заболевания. Так, при ретроспективном анализе структуры причин смерти у пациентов с ГПА доля нежелательных эффектов проводимого лечения была сходной с вкладом поражения легких в рамках основного заболевания – 35,1% и 37,8%, соответственно, а в проспективнои группе значительно превышала последний – 47,1% и 17,6%, соответственно [20]. Основные нежелательные эффекты циклофосфамида (инфекционные осложнения, геморрагическии цистит и рак мочевого пузыря, лимфопролиферативные заболевания, миелодисплазия, бесплодие) обусловлены его высокои токсичностью [20-22]. Применение ритуксимаба также сопряжено с высокой частотой нежелательных явлений (46%), прежде всего инфекций [23]. Поэтому поиск новых безопасных препаратов для терапии системных васкулитов остается актуальной проблемой. В настоящее время разрабатываются два ингибитора фактора C5a – авакопан, пероральный ингибитор рецептора C5a (C5aR), и IFX-1, моноклональное антитело к C5a [24]. Эффективность, безопасность и стероидсберегающее действие авакопана у пациентов с ГПА и МПА были показаны в двух исследованиях II фазы – CLEAR и CLASSIC [24,25]. Кроме того, завершено исследование III фазы (ADVOCATE), в котором авакопан изучали более чем у 320 больных с активным ААВ. Недавно была начата II фаза клинических исследований IFX-1 у пациентов с ААВ.

Основным ограничением нашего исследования была относительно небольшая выборка пациентов, особенно тех, которые были обследованы в динамике, т.е. в активную фазу ААВ и после достижения ремиссии системного васкулита. Часть пациентов с впервые выявленным ААВ и все больные с рецидивом заболевания получали иммуносупрессивную терапию, которая, вероятно, могла оказать влияние на уровни компонентов комплемента. Тем не менее, у всех больных на момент изучения системы комплемента имелись признаки активности заболевания, а полученные нами данные соответствуют результатам предыдущих исследований и подкрепляются мета-анализом всех имеющихся данных об активации системы комплемента при ААВ [26].

Заключение

Результаты нашего исследования подтверждают участие альтернативного пути активации системы комплемента в развитии ААВ. Признаки активации системы комплемента были обнаружены только у части пациентов с активным AAВ, тогда как достижение клинической ремиссии после иммуносупрессивной терапии не всегда приводило к нормализации уровней компонентов комплемента. Следовательно, мы не можем сделать вывод, что какой-либо компонент комплемента в плазме сам по себе может быть полезен в качестве биомаркера активности болезни или для определения тактики лечения. Тем не менее, исследования системы комплемента при AAВ открывают новые перспективы в разработке лекарственных препаратов для лечения заболевания.