Одним из современных подходов к классификации лекарственных средств в клинической фармакологии является их распределение в зависимости от таких факторов, как "зрелость" процессов производства, клинический опыт применения или готовность к клиническому применению, рентабельность производства и законодательно установленные механизмы возмещения прямых затрат [1]. Еще один важный критерий – возможность мониторирования нежелательных явлений и их предотвращения через систему управления рис ками в рамках работы системы фармаконадзора [2]. Исходя из совокупности указанных факторов, выделяют "состоявшиеся лекарства (mature)", к которым относят низкомолекулярные молекулы и биотехнологические препараты, и "развивающиеся лекарства (advancing)", к которым прежде всего относятся медицинские продукты передовой терапии (advanced therapy medicinal products). Особый интерес вызывает третья группа – "зарождающиеся лекарства (emerging)", одним из представителей которой считают систему редактирования генома CRISPR (clustered regulatory interspaced short palindromic repeats). Лекарства на основе систем редактирования генома относят к "генной терапии 2.0", так как их применение позволяет отказаться от доставки в клетку здоровых генов, а напротив, обеспечить удаление или восстановление собственных генов [3]. Система редактирования генома с использованием CRISPR получила дополнительное развитие после присуждения J. Doudna и E. Charpentier в 2020 году Нобе лев ской премии по химии за метод редактирования генома. Обоснование CRISPR как "генетических ножниц" рассматривается как одно из важнейших научных достижений столетия (рис. 1) [4]. Существуют и другие методы редактирования генома, в частности с помощью нуклеаз (zinc finger nucleases, ZFN, или transcription activator-like effector protein nucleases, TALEN), которые могут распознавать любую последовательность ДНК длиной около 18–21 пары оснований [5,6]. Однако их использование является более сложным и дорогостоящим, чем применение системы CRISPR [7].
С целью систематизации данных о возможностях и перспективах применения CRISPR/Cas9 в клинической фармакологии был проведен поиск в базах Pubmed и Elibrary по ключевым словам [CRISPR/Cas9] AND [gene editing] OR [gene therapy], [редактирование генов] ИЛИ [генная терапия] ИЛИ [клиническая фармакология]. В результате были найдены 2703 научных публикации в период с 2013 по 2024 г., в том числе поисковые и доклинические исследования – 1570, клинические исследования – 90, статьи, посвященные совершенствованию технологии CRISPR, – 1043. Результаты анализа этих публикаций представлены в настоящем обзоре.
В 1987 г. Y. Ishino и соавт. обнаружили повторяющиеся локусы в ДНК архей и бактерий, которые позднее были названы CRISPR – "короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами" (рис. 1) [8]. В 2002 г. был идентифицирован CRISPR-ассоциирован- ный ген, расположенный рядом с локусом CRISPR и кодирующий ассоциированные с CRISPR белки (CRISPR-associated protein – Cas) [9]. Всего известно четыре таких гена и около 92 белков Cas, наиболее изученным среди которых считают Cas9, выделенный из Streptococcus pyogenes.
В 2005 г. было обнаружено, что CRISPR разделены уникальными последовательностями в виде спейсеров (рис. 2). Спейсеры, разделяющие CRISPR, соответствуют последовательности генов бактериофагов и плазмид. Функция указанного локуса была установлена через 2 года, когда было показано, что система CRISPR/Cas опосредует адаптивный иммунитет прокариот к бактериофагам. Так, после инфицирования бактериальной клетки вирусом бактерия интегрируют короткие отрезки вирусной ДНК в свой геном, что в будущем предотвращает их повторное заражение данными вирусами (рис. 2). В 2011 г. было описано взаимодействие между разными РНК в системе CRISPR в процессе адаптивного иммунитета у бактерий. Через год в знаковой статье M. Jinek и соавт. (2012 г.) сообщалось, что CRISPR-ассоциированные нуклеазы можно запрограммировать на выполнение точного разреза в определенных участках ДНК [4]. В 2013 г. с помощью системы CRISPR/Cas II типа было осуществлено редактирование эндогенных участков генома в клетках млекопитающих [11]. Уже через 3 года система редактирования генов CRISPR/Cas9 была впервые применена у человека (рис. 1). У пациента с метастатическим немелкоклеточным раком легкого из крови были выделены иммунные клетки, в которых с помощью CRISPR/Cas9 был выключен ген, кодирующий белок PD-1 (programmed cell death 1). После культивирования отредактированные клетки были введены обратно пациенту [12].
Первый отчет о системном применении CRISPR терапии был опубликован в 2021 г.: у 6 пациентов с наследственным транстиретиновым амилоидозом применение системы редактирования генов in vivo привело к снижению концентрации транстиретина в плазме за счет выключения соответствующего гена (NCTO4601051) [13]. В 2023 г. в Великобритании и Европейском союзе, а в 2024 г. в США компаниями Vertex Pharmaceuticals и CRISPR Therapeutics был зарегистрирован первый лекарственный препарат на основе CRISPR под торговым наименованием Casgevy (эксагамглоген аутотемцел) для лечения серповидноклеточной анемии и трансфузионно-зависимой бетаталассемии [14]. Носителем данного лекарственного средства является лентивирус. Компоненты редактирования CRISPR вводятся в гемопоэтические стволовые клетки, выделенные из костного мозга пациентов. Лекарство не устраняет мутацию гена при серповидноклеточной анемии, но индуцирует отключающийся вскоре после рождения ген фетального гемоглобина, являющегося основным переносчиком кислорода у плода. Это происходит за счет отключения гена BCL11A, который подавляет транскрипцию гена γ-глобина, образующего тетрамерный белок вместе с α-глобином. Возобновление синтеза фетального гемоглобина позволяет уменьшить последствия образования аномальной формы гемоглобина.
CRISPR/Cas9 представляют собой комплекс рибонуклеопротеина, способный совершать разрывы в двуспиральной ДНК (double-stranded breaks, DSBs). Выделяют три основных типа рибонуклеопротеинов и еще 12 подтипов [7,10,15,16]. По сравнению с типами I и III, система II опирается на один белок Cas для точного нацеливания на определенную последовательность ДНК, поэтому она стала наиболее часто используемым инструментом редактирования генома [4]. При инфицировании бактериальной клетки вирусом процесс взаимодействия вирусной ДНК и ДНК бактерий происходит в 3 стадии: поглощение, транскрипция и интерференция (рис. 2) [10,15-19].
На стадии поглощения при первом попадании вируса в бактериальную клетку вирусная ДНК интегрируется в область спейсеров (протоспейсера), что позволяет бактериям запоминать вторгшийся вирус (рис. 2). При повторном заражении вирусом того же типа запускается стадия транскрипции. РНК-полимераза копирует участок ДНК из спейсерных областей CRISPR с образование незрелой CRISPR РНК (precrRNA). Параллельно с pre-crRNA происходит транскрипция трансактивирующей CRISPR РНК (transactivating CRISPR RNA – tracrRNA). Системам CRISPR/ Cas типа II требуется tracrRNA, которая играет роль в созревании crRNA. Каждая crRNA состоит из повторяющейся последовательности и спейсерной последовательности комплементарной ДНК вируса. Затем происходит образование комплекса tracrRNA и зрелой crRNA, который загружается на белок Cas9, образуя активный комплекс рибонуклеопротеина.
На стадии интерференции crRNA направляет рибонуклеопротеин к участку протоспейсера вторгающейся ДНК вируса. Однако Cas9 не будет расщеплять последовательность протоспейсера, если не существует соседней последовательности PAM (protospacer adjacent motif, мотив, примыкающий к протоспейсеру). PAM представляет собой короткую последовательность нуклеотидов (2–5 пар оснований) вторгающейся в клетку вирусной ДНК, примыкающих к последовательности, нацеленной на crРНК [20]. При этом спейсер в бактериальных локусах CRISPR не содержит последовательность PAM, что защищает его от действия нуклеазы Cas9 [21].
CRISPR/Cas9 используют ex vivo (вне организма) для модификации генома и культивирования клеток пациента в лаборатории перед возвращением их пациенту и непосредственно in vivo. Чтобы в полной мере использовать потенциал редактирования генов CRISPR/Cas9, необходимо эффективно ввести систему редактирования в клетки-мишени с использованием соответствующих векторов [22,23]. Выделяют вирусные и невирусные векторы.
Вирусные векторы. Среди многих вирусных векторов для доставки систем редактирования генома в доклинических и клинических исследованиях чаще всего используют аденоассоциированный вирус (adenoassociated virus, AАV) и лентивирус [24-26].
Невирусные векторы. Невирусные векторы обладают рядом преимуществ по сравнению с вирусными векторами, в частности, низкой иммуногенностью, высокой биосовместимостью, хорошей переносимостью, а также низкой стоимостью [27,28]. Системы доставки лекарств, основанные на нанотехнологиях (липидные, полимерные, золотые наночастицы), потенциально расширяют возможности применения терапии CRISPR/Cas9 и повышают ее безопасность. Прежде всего изучают роль липидных наночастиц (lipid-based nanoparticles, LNP).
Преимущества и недостатки каждого из видов векторов представлены в табл. 1.
| Стратегия доставки |
Объект доставки |
Ограничения | Преимущества | Применение |
|---|---|---|---|---|
| Лентивирус | CRISPR/Cas9 и sgRNA |
Риск нецелевых мутаций и ограниченная загрузочная способность в 10 кб оснований |
Доставка CRISPR в клетки за одну трансфекцию и высокая способность к клонированию. Низкая иммуногенность и стоимость |
In vitro |
| Аденоассоциированный вирус |
CRISPR/Cas9 | Включает фрагмент размером 4,7 кб, который легко интегрируется в геном хозяина |
Структурная гибкость, разнообразие серотипов и легкая адаптация для подавления иммунного ответа. |
In vitro |
| Аденовирус | CRISPR/Cas9 | Упаковка ограничена фрагментами размером 8 кб, иммунные реакции при наличии антител к аденовирусу, сложность производства |
Более низкий риск нежелательных лекарственных реакций и мутагенеза, а также лучшие клинические исходы |
In vitro |
| Вирусоподобные наночастицы |
РНК | Ограниченные возможности использования в практике вследствие нестабильности | Превосходная биозащита, низкая иммуногенность и пластичность |
In vitro |
| Липосомы | CRISPR/Cas9 | Высокие требования к условиям хранения и транспортировки, ограничения по объему доставляемой ДНК |
Высокая эффективность загрузки, безопасность редактирования, точность и специфичность |
In vitro |
| Экзосомы | CRISPR/Cas9 | Сложная технология производства, экстремальные условия хранения и транспортировки, а также нестабильность | Естественная способность к нацеливанию,сниженный иммунный ответ и превосходная биозащита | In vitro |
| Полимеры | CRISPR/Cas9 sgRNA |
Может накапливаться, а также дестабилизироваться | Малый размер, контролируемое высвобождение, способность к биологическому разложению, более низкая иммуногенность | In vitro |
| Неорганические наночастицы |
CRISPR/Cas9 | Медленная деградация in vivo, накопление в печени и специфическая токсичность in vivo | Малый размер, высокая эффективность доставки, замедленное контролируемое высвобождение, целенаправленное действие и способность покидать клетку | In vitro |
Основными средствами доставки CRISPR/Cas9 in vivo на 2023 г. являются векторы LNP и AАV [7,29].
Векторы на основе липидных наночастиц (LNP). Фармакокинетика LNP при внутривенном введении в значительной степени определяется характеристиками наночастиц. После внутривенного введения наночастицы подвергаются воздействию множества клеток и биомолекул, присутствующих в сосудистой системе, по мере их распространения в ткани и органы. На поверхности наночастиц может адсорбироваться белок [30]. Наночастицы могут выводиться из кровообращения системой мононуклеарных фагоцитов, почками и гепатобилиарной системой [31]. Более крупные частицы, не подвергающиеся фагоцитозу, выводятся печенью с калом. Наночастицы, которые остаются в крови, поглощаются клетками и высвобождают нуклеиновую кислоту в цитозоле. Cпособность наночастиц достигать органа-мишени в первую очередь определяется перфузией тканей. Считается, что наночастицы проникают в сосуды либо путем транспорта через внутриклеточные фенестрации, либо посредством трансцитоза. После экстравазации наночастица становится доступной для клеточного поглощения, чаще всего путем эндоцитоза (рис. 3). Благодаря высокой перфузии и фенестрации эндотелия печень особенно хорошо подходит в качестве органа-мишени для системной доставки наночастиц и для генной терапии.
Векторы на основе аденоассоциированного вируса (AАV). Показатели фармакокинетики препаратов на основе AVV подробно описаны N. Chen и соавт. (2022 г.) [32]. Важным фактором, определяющим тропизм AAV, а также путь элиминации, является его серотип. При использовании AAV следует учитывать риск инфицирования пациентов, поэтому в клинических исследованиях оценивают инфицированность секретов, например, мочи, кала, слюны, а также крови и спермы [29]. При применении в качестве переносчика рекомбинантного AAV, не способного к репликации, риск инфицирования пациентов сводится к минимуму.
В результате работы CRISPR/Cas9 происходит двухцепочечный разрыв ДНК клетки-мишени с последующей репарацией эндогенной ДНК (рис. 3). Репарация может осуществляться двумя механизмами: посредством негомологичного соединения концов (non-homologous end joining, NHEJ) и гомологичной репарации (homologydirected repair, HDR). Последний вариант позволяет искусственно сконструировать гомологичный фрагмент ДНК-матрицы (донорскую) и интегрировать его в геномную ДНК клетки для выключения гена [33]. HDR характеризуется более высокой точностью и предполагает наличие матрицы, обеспечивающей правильную последовательность исходной цепи ДНК [38]. Для осуществления DSB в правильном положении и запуска последовательности событий репарации ДНК используют программируемые нуклеазы.
В процессе NHEJ возможна потеря или выключение отдельных генов из-за сдвига матрицы [34-37]. Такой вариант репарации подвержен ошибкам, которые могут привести к накоплению небольших удалений и вставок в месте DSB. Ожидаемым результатом терапевтического редактирования генома является необратимое изменение последовательности ДНК, которое приводит к снижению продукции белка [29].
На рис. 3 изображен механизм действия CRISPR терапии с помощью лекарственного средства для лечения транстиретинового амилоидоза NTLA-2001, которое состоит из липидных наночастиц (LNP), содержащих молекулы CRISP/Cas9 и одну молекулу направляющей РНК (sgRNA), специфичную для гена человека, кодирующего транстиретин [29]. После внутривенного введения NTLA-2001 поглощается печенью за счет взаимодействия с рецепторами липопротеинов низкой плотности с последующим эндоцитозом. мРНК Cas9 и sgRNA высвобождаются в цитоплазму, где мРНК Cas9 с помощью рибосом клетки хозяина транслируется в белок Cas9. Затем sgRNA связывается с белком Cas9, образуя рибонуклеопротеиновый комплекс Cas9sgRNA. Комплекс проникает в ядро и распознает мотив, примыкающий к протоспейсеру (PAM) на некомплементарной цепи ДНК клетки человека. sgRNA связывается с целевым сайтом, что приводит к изменениям в белке Cas9 и, в конечном итоге, к двухцепочечному разрыву ДНК. Эндоген ные механизмы обеспечивают восстановление разреза и создание вставок или делеций (инделов), что приводит к снижению выработки транстиретина.
При CRISPR терапии, как и при генной терапии, имеются сложности с выбором эффективной терапевтической дозы [39]. Разработке CRISPR терапии предшествовала разработка малых интерферирующих РНК (small interfering RNA, siRNA), поэтому накопленный опыт их применения послужил отправной точкой при выборе дозы лекарственных средств CRISPR терапии. Примером расчета дозы CRISPR терапии in vivo является расчет дозы лекарственного средства NTLA-2001 для лечения пациентов с транстиретиновым амилоидозом [29]. Доклинические исследования на мышах и яванских макаках показали, что однократное введение NTLA-2001 хорошо переносится и приводит к выраженному снижению сывороточного содержания транстиретина. Доза NTLA2001, не вызывавшая нежелательных реакций у яванских макак, составила 3 мг/кг. Максимальная рекомендуемая начальная доза NTLA-2001 была определена как 0,1 мг/кг на основе масштабирования общей площади поверхности тела и коэффициента безопасности 10. В открытом многоцентровом исследовании "доза-эффект" были изучены результаты введения NTLA-2001 в дозах 0,1–1,0 мг/кг. В дозах 0,7 и 1,0 мг/кг препарат вызывал снижение содержания транстиретина более чем на 90% через 28 дней, а достигнутый эффект сохранялся в течение 4-6 месяцев. Лекарство в указанных дозах хорошо переносилось, что в сочетании с фармакокинетическими данными указывало на отсутствие необходимости в дополнительной коррекции дозы по площади поверхности тела [40]. Для дальнейшего изучения эффективности была выбрана фиксированная доза 55 мг, эквивалентная 0,7 мг/кг.
В обзоре B. Cerci и соавт. (2023 г.) представлена подробная информация о 28 исследованиях, в которых CRISPR/Cas9 вводили ex vivo, и 6 исследованиях – invivo [7].
Исследования, в которых CRISP/Cas9 использовали ex vivo
ВИЧ-инфекция. В настоящее время в лечении пациентов с ВИЧ-инфекцией рассматривается сочетание технологии CRISPR с высокоактивной антиретровирусной терапией, которое потенциально позволит одновременно ингибировать репликацию вируса и удалять фрагменты ДНК вируса иммунодефицита человека, интегрированные в геном человека [41]. В настоящее время большинство исследований, предполагавших редактирование генома ВИЧ-инфицированных клеток, проведены in vitro, в то время как внедрение этого метода в клиническую практику требует проведения дальнейших экспериментов in vivo [42].
Мышечная дистрофия Дюшенна – Х-сцепленное рецессивное генетическое заболевание, характеризующееся мутациями в гене дистрофина и сопровождающееся прогрессирующим поражением скелетных мышц в сочетании с кардиомиопатией [43]. Потенциальное направление разработки генной терапии мышечной дистрофии Дюшенна – использование системы CRISPR/Cas для вставки гена Dys [23,44]. В доклиническом исследовании у собак показано, что замена гена приводит к увеличению экспрессии дистрофина и клиническому улучшению [45]. Результаты лечения зависели от возраста животных и тяжести мышечной патологии на момент вмешательства.
Гемофилия – наследственное нарушение свертывания крови в результате дефицита факторов VIII (гемофилия А) или IX (гемофилия В). В эксперименте J. Lee и соавт. (2023 г.) с помощью системы CRISPR/Cas9 был введен ген человеческого фактора IX в ген антитромбина. В результате было достигнуто снижение уровня антитромбина и увеличение продукции фактора IX, что привело к улучшению функции свертывания крови [46].
Муковисцидоз – аутосомно-рецессивное моногенное наследственное заболевание, характеризующееся поражением всех экзокринных желез, а также жизненно важных органов и систем и связанное с мутациями гена регулятора трансмембранной проводимости (Transmem brane Conductance Regulator, CFTR), которые вызывают нарушение транспорта ионов хлора. S. Amistadi и соавт. (2023 г.) использовали стратегию редактирования адениновых оснований на основе CRISPR для коррекции мутаций без индуцирования двухцепочечных разрывов ДНК. Эффективность метода достигала 70% [47]. В настоящее время генная терапия муковисцидоза с использованием системы редактирования CRISPR/Cas9 была успешно использована на нескольких моделях заболевания у животных [48].
β-талассемия. Талассемия – это группа аутосомнорецессивных гемоглобинопатий, сопровождающихся нарушением синтеза альфа- или бета-глобиновых цепей, входящих в состав гемоглобина, которое приводит к неэффективному эритропоэзу, преждевременному разрушению эритроцитов и развитию анемии с формированием зон экстрамедуллярного кроветворения [49]. В 2021 г. сообщалось об эффективном использовании системы CRISPR/Cas9 для модификации генов аутологичных гемопоэтических стволовых клеток, выделенных у пациентов с талассемией [50,51], а в 2023 г. был зарегистрирован первый лекарственный препарат на основе CRISPR для лечения трансфузионно-зависимой бета-талассемии [14].
Семейная гиперхолестеринемия – моногенное заболевание с преимущественно аутосомно-доминантным типом наследования, сопровождающееся значительным повышением уровня холестерина липопротеидов низкой плотности в крови, и как следствие, ранним развитием и прогрессирующим течением атеросклероза. Для лечения семейной гиперхолестеринемии (СГХС) применяют статины, эзетемиб и ингибиторы PCSK9. H. Okada с соавт. (2019 г.) использовали индуцированные плюрипотентные стволовые дифференцированные гепатоцитоподобные клетки. Для получения гомозиготного и двух гетерозиготных клонов использовали редактирование гена с помощью CRISPR/Cas9. Полученные клетки обладали низкой иммуногенностью, что позволяет предположить возможность применения генноскорректированных гепатоцитоподобных клеток, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, для лечения СГХС [52].
CAR-T терапия злокачественных опухолей. Для терапии Т-клетками с химерным рецептором антигена (chimeric antigen receptor T-cells, CAR-T) используют собственные генетически модифицированные Т-клетки пациента, экспрессирующие синтетический рецептор, который распознает специфические антигенные мишени на опухолевых клетках [53,54]. Несмотря на эффективность, терапия аутологичными CAR-Т-клетками имеет ограничения, включая высокую стоимость и истощение Т-клеток пациента. Редактирование CRISPR/Cas9 может быть использовано для разработки аллогенной терапии CAR-Т-клетками, которая решит многие проблемы, связанные с применением аутологичных CAR-Т-клеток. Редактирование клональных мастер-линий потенциально позволит получить возобновляемый источник клеток, который можно многократно использовать для массового производства однородных CAR-Т, что позволит снизить стоимость терапии. В настоящее время в клинических исследованиях изучаются многочисленные варианты терапии с использованием CRISPR/Cas9 для генетической модификации аутологичных или аллогенных Т-клеток или CAR-T-клеток против различных гематологических и солидных раковых заболеваний [7].
Сахарный диабет. Сахарный диабет 1 типа представляет собой аутоиммунное заболевание, характеризующееся прогрессирующим иммуноопосредованным разрушением β-клеток в островках поджелудочной железы, которое приводит к абсолютному дефициту инсулина уже в детском или подростковом возрасте [55]. Хотя трансплантация островковых клеток оказалась успешной у некоторых пациентов с сахарным диабетом 1 типа, ее широкое применение ограничено нехваткой доноров островковых клеток и необходимостью пожизненной иммуносупрессии. Стратегия инкапсуляции, которая может предотвратить отторжение ксеногенных островков или аллогенных островков, полученных из стволовых клеток, потенциально может устранить оба этих барьера. Несмотря на то, что технология инкапсуляции столкнулась с рядом проблем, объединение опыта в области материалов, нанотехнологий, биологии стволовых клеток и иммунологии позволяет нам приблизиться к цели – терапии инкапсулированными островковыми клетками [56]. К сожалению, клиническая эффективность ее ограничена из-за снижения жизнеспособности клеток, а in vivo секреция инсулина у пациентов с сахарным диабетом 1 типа не увеличивалась. В недавно опубликованном клиническом испытании исследователи обеспечили жизнеспособность трансплантированных клеток, разработав систему инкапсуляции, но пациентам требовалась иммуносупрессивная терапия [57]. Для предотвращения необходимости в иммуносупрессивной терапии перспективен нокаут генов B2M и PD-L1 с помощью системы CRISP/Cas9 в стволовых клетках пациента перед трансплантацией [58].
Врожденный амавроз Лебера 10 типа обусловливает дистрофию сетчатки, которая приводит к потере зрения в первый год жизни. Мутации, вызывающие заболевание, в основном возникают в гене CEP290. В клиническом исследовании EDIT-101 впервые выполнена субретинальная инъекция лекарственного препарата, предназначенного для восстановления мутантного аллеля CEP290 IVS26 [59]. Препарат представляет собой плазмиды, содержащие гены, которые кодируют две направляющие РНК. В качестве вектора выбран AAV5.
Герпетический вирусный кератит. Вирус простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) – это наиболее часто встречающийся подтип вируса герпеса. Первое клиническое исследование для оценки безопасности и эффективности терапии CRISPR/Cas9 у больных герпетическим вирусным кератитом было начато в 2022 г. [60]. Это открытое исследование лекарственного средства BD111 с однократной возрастающей дозой у взрослых пациентов в возрасте от 18 до 70 лет с рефрактерным герпетическим вирусным кератитом. BD111 — это новый продукт для редактирования генов, разработанный для уничтожения ВПГ-1.
Наследственный транстиретиновый амилоидоз. Редкое заболевание, вызываемое мутациями в гене TTR, кодирующем белок транстиретин, который в основном вырабатывается печенью. В клиническом исследовании фазы 1 изучали безопасность, переносимость, фармакокинетику и фармакодинамику лекарственного средства NTLA-2001, предназначенного для разрушения аллели TTR в гепатоцитах у пациентов с наследственным транстиретиновым амилоидозом [61]. Недавно опубликованные промежуточные результаты этого клинического исследования показали, что внутривенное введение NTLA-2001 шести пациентам привело к снижению уровня транстиретина в сыворотке крови на 28-й день в среднем на 52% (47–56%) при применении низкой дозы и на 87% (80–97%) при назначении высокой дозы [7]. Планируется 24-месячное наблюдение для оценки безопасности и клинических результатов лечения NTLA-2001 у пациентов с наследственным транстиретиновым амилоидозом.
Наследственный ангионевротический отек. Потенциально фатальное аутосомно-доминантное заболевание, связанное со снижением активности белка-ингибитора C1 (C1-INH), которое приводит к увеличению выработки калликреина и брадикинина. В 2021 г. разработан метод редактирования гена калликреина B1 для снижения уровня этого медиатора в плазме (лекарственное средство NTLA-2002). Эффективность препарата изучается в клиническом исследовании фазы 1/2 у пациентов с наследственным ангионевротическим отеком [62].
Дислипидемия. Гомеостаз липидов в плазме представляет собой многофакторный процесс, опосредованный регуляцией синтеза холестерина, секрецией липопротеинов и реабсорбцией печенью. В клиническом исследовании VERVE-101 изучается технология редактирования оснований, предназначенная для снижения экспрессии гена PCSK9 в печени и снижения уровня циркулирующего PCSK9 и липопротеинов низкой плотности у пациентов с семейной гиперхолестеринемией и сердечно-сосудистыми заболеваниями [63].
Иммуногенность. Иммуногенность CRISPR терапии обусловлена преимущественно природой носителя (AAV и LNP) и трансгенного продукта, включая белок Cas9. Как врожденные, так и адаптивные иммунные реакции могут влиять на безопасность и эффективность переноса генов, опосредованного прежде всего вектором AAV, и в некоторых случаях приводят к развитию инфузионных реакций, гепатотоксичности и тромботической микроангиопатии [29]. Если мРНК кодирует белок с высоким уровнем экспрессии, особенно у пациентов, у которых нет эндогенного белка из-за генетических мутаций, необходим мониторинг антител к продукту трансгена. Если трансген содержит мРНК Cas9 бактериального происхождения, белок Cas9 может вызывать как Т-, так и В-клеточный иммунный ответ в дополнение к ранее существовавшему иммунитету, обусловленному предшествующим воздействием Streptococcus или Staphylococcus. Пациентам, получающим мРНК Cas9, рекомендуется мониторировать образование антител против белка Cas9, а также проводить дополнительную оценку их потенциального влияния на фармакокинетику, фармакодинамику и безопасность. Остается неясным вопрос, как данную технологию применять в условиях реальной клинической практики.
Неточное, или "нецелевое" редактирование генома потенциально может привести к генотоксичности и развитию других непредвиденных последствий. Основной причиной нецелевых мутаций, возникающих под действием программируемых нуклеаз, является наличие в других частях генома последовательностей ДНК, которые очень похожи на предполагаемый целевой локус. Выяснение причин нецелевого эффекта является ключом к снижению риска развития нежелательных лекарственных реакций. Когда направляющая sgРНК распознает ДНК-мишень путем комплементарного спаривания оснований, возможно ошибочное распознавание участка ДНК, который в высокой степени гомологичен последовательности ДНК-мишени, но им не является. Нецелевой эффект CRISPR/Cas9 был продемонстрирован в исследованиях генома растений и при использовании систем редактирования генов в клинической практике [29,64].
Существуют два основных вида несоответствий между направляющей sgРНК и ДНК-мишенью: длина последовательности sgРНК такая же, как и у нецелевого участка ДНК, но с несколькими несовпадающими основаниями; отличные по длине, но сходные по нуклеотидным последовательностям на определенных отрезках sgРНК [65,66]. Возможность появления нецелевого эффекта серьезно ограничивает применение технологии CRISPR/Cas9.
Появление технологии CRISPR/Cas9 с ее простотой, точностью и эффективностью значительно усовершенствовало процесс редактирования генов. В то же время значительные достижения в разработке технологии CRISPR/Cas9 привели к возникновению проблем в регулировании ее безопасного и этичного использования [67-69]. Первый Международный саммит по редактированию генома человека состоялся в декабре 2015 года. В нем приняли участие более 500 исследователей, политиков, специалистов по этике, представителей медицинских и научных сообществ и групп пациентов. Обсуждались потенциальные преимущества и риски редактирования генома человека, культурные и этические аспекты, вопросы регулирования, а также работа с общественностью. В принятом заявлении была отмечена необходимость в интенсивных фундаментальных и доклинических исследованиях методов редактирования генома в соответствии с надлежащими правовыми и этическими нормами. В целом отношение экспертов к модификациям соматической ДНК отдельного человека является более терпимым, чем отношение к редактированию клеток зародышевой линии, результаты которого могут передаваться потомству [70,71]. В некоторых странах проведение генетических модификаций клеток зародышевой линии запрещено, а преимущества и риски этого подхода недостаточно изучены [72].
Система CRISPR/Cas9 является инструментом редактирования генома, который имеет крайне широкое потенциальное применение во многих областях, начиная от фундаментальной биологии и заканчивая терапией различных заболеваний человека. Выделяют клинико-фармакологические показатели, отличающие CRISPR терапию от предыдущих классов лекарственных средств. Во-первых, успешное клиническое применение CRISPR терапии во многом зависит от выбора средства доставки. Первоначально для этого использовали вирусные векторы, однако в последних исследованиях чаще изучаются средства на основе LNP.
Показатели фармакокинетики средств доставки могут влиять на характеристики препарата на основе CRISPR, особенно до его поглощения целевой популяцией клеток. Во-вторых, для достижения терапевтически значимых эффектов, опосредованных стойким выключением соответствующего гена, возможно однократное введение препарата, в отличие от других классов лекарственных средств, в частности малых молекул, которые приходится назначать на длительный срок.
Широкому внедрению CRISPR терапии в клиническую практику препятствуют риск нецелевого редактирования генома, иммуногенности нуклеаз Cas9 и канцерогенных эф фектов компонентов CRISPR. Также необходимо учитывать, что в большинстве постмитотических эукариотических клеток DSB в основном восстанавливаются посредством NHEJ, что приводит к накоплению ошибок. Недавно были разработаны новые варианты CRISPR/Cas, которые в меньшей степени оказывают нецелевое действие и вызывают HDR, сопровождающихся меньшим риском ошибок [7]. Одним из основных направлений развития системы CRISPR/Cas9 являются повышение эффективности и снижение риска нецелевого редактирования. Работы по совершенствованию CRISPR терапии направлены на оптимизацию внутренней последовательности системы CRISPR/Cas9 и направляющей sgРНК, снижение рисков нецелевого редактирования, усовершенствование систем доставки и изменение стратегии репарации ДНК [34,73].